Proses Transkrip Pasca-Transkripsi

Pemotongan dan penyambungan RNA ( splicing )

Pada eukaryot banyak terdapat gen yang organisasinya tersusun atas akson dan intron, meskipun tidak semua gen eukaryot mempunyai intron. Pada awalnya, gen yang terdiri atas ekson dan intron yang ditranskipsi menghasilkan pre-mRNA (transkripsi primer, primary transcpt ) karena masih mengandung sekuensi intro. Pada tahapan selanjutnya intron akan dipotong dari pre-mRNA dan ekson-ekson yang ada selanjutnya disambung menjadi mRNA yang matang ( mature mRNA ). Proses pemotongan intron dan penyambungan kembali ekson-ekson disebut sebagai proses penyambungan RNA ( RNA splicing ). Transkripsi mRNA yang sudah matang inilah yang selanjutnya akan ditranslasi.

Proses splicing RNA adalah proses yang sangat akurat. Akurasi proses pemotong dan penyambungan ditentukan oleh suatu urutan nukleotida yang dikenal sebagai splicing signals. Sejauh ini nukleotida lestari yang ditemukan pada beberapa intron yang berbeda yang diketahui adalah dua nukleotida pada ujung intron, yaitu :

Ekson-GU..............AG-ekson

Selain urutan tersebut juga ada urutan kosensus pada bagian pertemuan antara ekson dan intron. Pada gen-gen yang ada dalam nukleus, urutan konsesusnya adalah sebagai berikut :

A64 G73 G100 U68 A68 A68 G84 U63...............Gpy74-87 n C65 A100 G100 n

Angka-angka menunjukkan persentase frekuensi nukleotida pada tiap posisi, jika angkanya 100 berarti basa tersebut selalu berada pada posisi tersebut. N dan py menyatakan nukleotida apa pun atau basa pirimidin yang mungkin ada pada posisi tersebut. Urutan nukleutida pada bagian pertemuan ekson-intron tersebut berbeda untuk gen tRNA dan gen struktural pada mitokondria dan kloroplas karena adanya perbedaan dalam hal mekanisme pemotongan-penyambungan RNA-nya. Pada gen-gen yang ada dalam nukleus hanya ada dalam urutan nukleotida lestari. (conserved ) yang pendek yaitu tactaac, yang terletak sekitar 30 pasangan basa di sebelah hulu dari sisi 3’ penyambungan. Residu adenine pada posisi keenam kotak tactaac adalah residu yang lestari dan mempunyai peranan sangat penting dalam proses pemotongan-penyambungan intron-ekson. Secara umum dapat disebut bahwa sekuens intron pada gen-gen dalam nukleus bersifat acak, kecuali sekuens dinukleutida gt dan ac serta kotak tactaac. Intron pada gen-gen dalam inti sel. Sekuens konsensus pada daerah perbatasan antara ekson-intron pada prekursor mRNA khamir telah diketahui dengan urutan sebagai berikut :

5’ – GUAUGU – intron - UACUAAC – pyAG – 3’

Dari beberapa penelitian diketahui bahwa sinyal untuk pemotongan intron dan penyambungan ekson ( splicing signals ) pada prekursor mRNA gen-gen pada nukleus sangat seragam, yaitu kedua basa intron pertama hampir selalu mengandung gu dan dua basa terakhir hampir selalu mengandung ag. Selain itu, keseluruhan sekuens konsensus sangat penting untuk pemotongan intron dan penyambungan ekson secara tepat. Mutasi pada sekuens konsensus dapat mengakibatkan splicing yang abdnormal. Sifat lestari ujung 5’ dan 3’ pada posisi pemotongan-penyambungan serta kotak tactaac menunjukan bahwa hal ini mempunyai fungsi sangat pen ting dalam ekspresi genetik. Mutasi pada bagian tersebut dapat menyebabkan perubahan fenotip pada banyak jasad eukaryot. Sebagai contoh, mutasi pada daerah ini seringkali bertanggung jawab dalam pemunculan penyakit menurun pada manusia, misalnya kelainan hemoglobin.

Penelitian menunjukan bahwa proses pemotongan intron dan transkrip RNA terdiri atas tiga tipe yang bebeda yaitu :

1. Intron pada prekursor tRNA dipotong dengan menggunakan endonuklease secara tepat diikuti oleh reaksi ligasi ( penyambungan ) menggunakan enzim ligase.
2. Intron pada beberapa prekursor rRNA dihilangkan dengan mekanisme auto katalitik melalui reaksi unik yang melibatkan molekul RNA itu sendiri dan tidak melibatkan aktivitas enzim.
3. Intron pada pre-mRNA dipotong dengan mekanisme reaksi dua-langkah yang dilakukan oleh partikel ribonukleoprotein yang disebut spliceosome.

Mekanisme splicing prekursor mRNA inti sel

Proses splicing menghasilkan suatu struktur cabang yang disebut dengan lariat karena bentuknya seperti tali laso. Pada tahap pertama, gugus 2’-oh nukleotida adenine yang ada dalam intron menyerang ikatan fosfodiester yang menghubungkan ekson 1 dengan intron. Hal ini menyebabkan terputusnya ikatan ekson 1 dengan intron sehingga dihasilkan ekson 1 yang bebas dan struktur lariat yang merupakan gabungan antara intron dengan ekson 2. Struktur lariat tersebut mempunyai ujung 5’ gu yang berikatan dengan titik percabangan melalui ikatan fosfodiester antara intron dengan ekson 2, menghasilkan struktur intron berbentuk lariat dan ekson 1/ ekson 2 yang bersambungan. Penyambungan antara ekson 1 dan ekson 2 diperantai oleh gugus fosfat pada ujung 5’ ekson 2.

Penelitian pada khamir menunjukan bahwa spilicing berlangsung didalam suatu partikel berurutan 40s yang disebut sebagai spliceosome. Partikel tersebut mempunyai peranan sangat penting dalam splicing karena pre-mRNA yang mengalami mutasi A menjadi C.

Pada titik percabangan tidak dapat mengalami splicing. Hal itu disebabkan RNA semacam ini tidak mampu membuat struktur spliceosome. Selain partikel spliceosome, faktor lain juga berperan penting dalam splicing adalh molekul RNA berukuran kecil yang disebut small nuclear RNA ( snRNA ) yang berasosiasi dengan suatu protein membentuk kompleks small ribonuclear proteins ( snrnp, dibaca “ snurp “ ). Kompleks tersebut dapat dipasangkan dipisahkan dengan elektroforesis gel menghasilkan partikel-partikel individual yangb disebut u1, u2, u4, u5 dan u6.

Mekanisme splicing secara autokatalik

Mekanisme ini terjadi pada prekursor rRNA tanpa melibatkan enzim. Lebih jauh telah diketahui pula bahwa mekanisme semacam ini juga terjadi pada pemotongan intron prekursor rRNA, tRNA, mRNA yang ada pada mitokondria dan kloroplas banyak spesies, misalnya pemotongan intron gen 26s rRNA dan tetrahymena. Mekanisme splicing autokatalitik tidak memerlukan energi maupun enzim tetapi melibatkan reaksi transfer ikatan fosfoester tanpa ada ikatan yang hilang. Proses pemotongan intron secara autokatalitik dapat dibedakan menjadi dua yaitu pada gen-gen yang mengandung intron grup i dam intron grup ii.

Pada intro grup i ( misalnya 26s rrn pada tetrahymena ), proses splicing melibatkan penambahan nukleotida guanine pada ujung 5’ intron. Guanine tersebut adalah nukleotida yang berasal dari luar, bukan bagian integral intron seperti yang diamati pada splicing menggunakan spliceosome. Pada tahap pertama, nukleotida guanine menyerang nukleotida adenine pada ujung 5’ intron dan melepaskan ekson 1. Pada tahap kedua, ekson 1 menyerang ekson 2 sekaligus melakukan penyambungan ekson 1 dan ekson 2 serta melepaskan intron berbentuk linier. Selanjutnya, dengan proses yang berbeda, intron linier dipotong nukleotidanya sebanyak 19 nukleotida dari ujung 5’.

Mekanisme splicing precursor tRNA

Mekanisme splicing precursor tRNA pada sacchromyces cerevisiaemalaui du tahapan. Dalam tahapan pertama, enzim yang disebut splicing edonuklease (tRNA endonucleasse) yang terikat pada memberan nucleus melakukan dua pemotongan secra tepat pada kedua ujung intrn. Selanjutnya pada tahap ke dua suatu enzim yang disebut splicing ligase (RNA ligase) menyambung kedua bagian tRNA sehigga dihasilkan molekul tRNA yng sedah matang.

Beberapa mekanisme splicing yang dijelaskan adalah mekanisme cis splicing yaitu proses splicing yng melibatkan dua ekson atau lebih yang ada pada gen yang sma. Penelitian pada triphanosoma, protozoa yang memiliki alatgerak flagella, menunjukkan ada mekanisme splicing alteRNAtive yang disebut trans-splicing . Pada trans-splicing ekson-ekson yang digabungkan erasal dari gen yang sama, bahkan dapat berasal dari kromosom yang berbeda. Penelitian yang lebih lanjut pada jasad ini menunjukkan bahwa semua mRNA mempunyai 35 nukliotida awal (leader), disebut sebagai splicid leader(sl), tetapi gen-gen yang mengkode mRNA tersebut tidak mempunyai urutan komplementer ke 35 nukleotida awal. Gen yang mengkode sl tersebut diketahui berulang sekitar 200 kali pada genon tripanosoma. Gen tersebut hanya mengkode sl ditambah 100 nukleotida yang tersambung pada sl melalui skekuen splising. Consensus pada ujung 5’. Dengan demikian gen mini tersebut tersusun ekson sl yang pendek dan ujung 5’ suatu intron.

Poliadenilasi mRNA

Transkrip mRNA pada eukariot juga mengalami pemprosesan dalam bentuk penambahan polia (ranntai amp). Pada ujung 3’ sepanjang kurang lebih 200-250 nukletida. Penambahan polia semacam ini tidak terjadi pada rRNA maupun tRNA. Rantai polia tersebut ditambahkan pasca transkripsi karena tidak ada bagia gen yang mengkode rangkaian a atau t semacam ini. Penambahan tersebut dilakukan dengan menggunakan aktivitas enzim poli(a) polimease yang ada di dalam nucleus. Sebagai besar mRNA mengandung polia kecuali mRNA histon.

Penambahan polia pada ujung 3’ meningkatkan stabilitas mRNA sehingga mRNA memiliki umur yang leih panjang dibandingkan mRNA yang tidak memiliki polia. Selain itu juga ada bukti yang mununjukkan bahwa keberadaan poli a meningkatkan efisies=nsi translasi mRNA semacam itu. Diketahui ada suatu protein, yaitupoli(a) bindng protein i., yang menenpel pada polia sehingga meningkatkan eisiensi translasi. Bukti lain juga menegaskan bahwa mRNA yang mempunyai polia, mempunyai kemungkinan yang lebih tinggi untuk mengikat ribosom sehingga dapat meningkatkan efisiensi translasi dibndingkan mRNA yang tidak mengalami poliadenilasi. Poliadenilasi dlakukan pada prekusor mRNA bahkan sebulum terjadi termnasi transkripsi. Hal tersebut dlakukan dengan cra memoton prekusor mRNA pada bagian yang nantinya akan menjadi bagian mRNA yang matang, kemudian dilanjutkan dengan penambhan polia paa ujung 3’ yang terbuka. Bagian mRNA yang isentesis setelah poliadenilasi selanjutnya akan didegradasi.

Tempat dilakukannya poliadenilasi dicirikan oleh suatu sinyal poliadenilasi pada gen mamalia. Sinyal tersebut terdri aas rankaian nukleotida aataaa yang diikuti oleh sekitas 20 tida yang kaya kakn residu gt serta diikuti oleh motif yang kaya akan t. Transkrip mRNA pada tanaman dan khamir juga mengalami poliadenilasi tetapi sinya poliadenilasinya berbeda dari yang ada pada mamalia karena ada variase pada sekuens aataaa. Pada khamir jarang sekali ada moif aataaa yang ditemukan.

Penambahan tudung (cap) pada mRNA

Pada mRNA eukariot mengalami meilasi (penambahan gugus metal) yang sebagian besar terakumulasi pada ujung 5’ mRNA. Struktur ini kemudian dikenal sebagai tudung mRNA (mRNA cap). Pada perkembangan selanjutnya, tudung mRNA tersebut merupakan molekul 7 metilguanosin (m7g). Tudug mRNA tersebut disintesis dalam beberapa tahap. Pertama, enzim RNA triposphatase memotong gugus fosfat pada ujung pre-mRNA, kemudian nzim guanilil transferase menambahkan gnp. Selanjutnya, enzim metal transferase melakukan metilasi tudung guanosin pada n7 dan gugus 2’-o metal pada nukleotida pada ujung tudung tersebut. Proses penambahan tudung tersebut berlagsung pada tahapan awal transkripsi sebulum transkrip mencapai panjang 30 nukleotida.

Tudung mRNA memiliki empat macam fungsi yaitu :

1. melindungi mRNA dari degradasi,
2. meningkatkan efisiensi translasi mRNA,
3. meningkatkn pengangkutan mRNA dari nucleus ke sitoplasme,
4. meningkatkan efisiensi proses splicing mRNA.

Tudung m7g berikatan dengan mRNA melalui ikatan trifosfat dan hal ini diperkirakan untuk melindungi mRNA dari serangan RNAse yang tidak dapat memotong ikatan triphosphat. Tudung tersebut juga meningkatkan efisiensi translasi karena ribosom dapat mengakses mRNA melalui suatu protein yang menempel pada tudung. Dengan demikian, jika tida ada tudung, maka proein yang melekat pada tudung tidak dapat menempel. Hal itu akhirnya mengurangi kemungkinan ribosom untuk menempel dan melakukan translasi.

Pemrosesan rRNA dan tRNA

Molekul rRNA yang dihasilkan pada prokariot maupun eukariot pada awlnya berupa prekosor yang erukuran leih anjang dari molekul yang matang. Sebagai contoh, pada mamalia, dihasilkan prekuso rRNA yang berukuran 45s yang sesungguhnya terdiri atas ukurang yang lebih kecil yaitu 28 s, 18s, dan 5,8s. Nukleotida diantara unit-unit kecil tersebut harus dipotong (diproses) untuk menghasilkan unit-unit fungsional yang lebih kecil. Perlu diperhaikan bahwa pemrosesan prekusor rRNA yang dimaksud disini buknlah splicing, karena splicing adalah proses pemotongan intron yang ada di dalam struktur inteRNAl transkrip dan diikuti oleh penyambungan ekson. Pada pemrosesan prekusor rRNA semacam ini idak ada penyambungan kembali molekulmolekul rRNA yang sudah dipotong karena masing-masing unit yang dihailkan adalah unit independen.

Selain rRNA, molekul tRNA juga disintesis juga disintesis dalam dibentuk prekusor. Pada prokariot, prekusor tersebut dapat terdiri atas satu tRNA atau lebih, atau kadang bercampur dengan rRNA. Untuk memotong prekusor yang terdiri atas lebih dari satu tRNA atau campuran tRNA danrRNA pada prokariot diperlukan aktifitas enzim RNAse iii. Setelah dipotong , tRNA masih mengandung beberapa nukleotida pada ujung 5’ maupun 3’. Demikian pla pada eukariot, ujung5’ dan 3’ pada prekusor tRNA mengandung beberapa nukleotida. Nukleotida tambahan yang ada pada ujung 5 ‘ pada prekusor tRNA prokariot maupun eukariot akan dipotong oleh enzim RNAse p, sedangkan ujung 3’nya akan diproses dengan enzim RNAse d., RNAse bn, RNAse t, RNAse ph, RNAse ii, dan polinukleotida osforilase (PNPase).

Penyuntingan RNA

Selain fenomena trans-splicing, pada tripanosoma juga terdapat mekanisme pasca transkripsi lain yang aneh yang disebut sebagai penyuntingan RNA (RNA editing). Pada perkembangan selanjutnya diketahi bahwa sekuen mRNA sitokrom oksidase ii (coii) pada tripanosoma ternyata tidak sesuai dengan sekuens gen yang mengkodenya. Sekuens mRNA coii diketahui mengandung 4 nukleotida yang tidak terdapat pada gen coii yang ada di dalam kinetoplast (semacam mitokondria yang mengandung dua dna lingkar yang terikat bersama menjadi struktur catanane). Ketiadaan keempat nukleotida tersebut pada gen coii nampaknya dapat menyebabkan terjadinya mutasi pergeseran pola baca (framehift) yang dapat menyebabkan gen menjadi tidak ktif. Meskipun demikian, mRNA yang dihasilkan ternyata mengandung empat nukleotida tersebut sehingga tidak terjadi pergeseran pola baca. Rob banne berkesimpulan bahwa mRNA tripanosoma tersebut dikopi dari suatu gen yang tidak lengkap, disebut sebgai cryptogene, kemudian disun ting lagi dengan menambahkan empat nukleotida yang kesemuanya adalah urdine.

Penelitian-penelitian berikutnya membuktian bahwa penyuntingan mRNA memang fenomena umum pada tripanosoma. Bahkan, beberapa mRNA isunting secara sangat ekstensif, misalnya sukuens mRNA coii trypanosoma brucei sepanjang 731 nukleotiga mengandung 407 uridine (u) yang ditambahkan melalui proses penyuntingan. Selain penambahan, penyuntingan pada mRNA coii juga menghilangkan 19 uridine yang dikod. Fenomena penyuntingan tersebut diketahui selalu terjadi pada ujung 3’ dn tidak ada pada ujung 5’ dengan orientasi 3’ ke 5’. Penyuntingan tersebut diketahui dilakukan oleh suatu molekul RNA yang disebut sebagai guide RNA (gRNA). Molekul gRNA tersebut berhibidisasi dengan baigian mRNA yang tidak di edit dn menyediakan nukleotida a dan g sebagai cetakan untuk penggabungan nukleotida u yang tidak ada pada mRNA. Kadang-kadang gRNA tidak mempunyai a atau g yang dapat berpasangan dengan u pada mRNA sehingga nukleotida tersebut dihilangkan menggunakan enzim eksoniklease.

Note : semoga mudah dimengerti.. Amiend.. ^^